Статьи

Появление новых, более эффективных программ лечения онкологических заболеваний существенно увеличило не только длительность жизни больных, но и число излечившихся. Эти достижения заставили онкологов и врачей других специальностей задуматься о качестве жизни этих пациентов. Использование лечебных программ последнего поколения при лимфоме Ходжкина (ЛХ) позволило достичь 10-летней общей выживаемости, превышающей 90% независимо от стадии заболевания [1,8,9,11]. При этом по данным как отечественной, так и зарубежной литературы беременность и роды не влияют на течение ЛХ, длительность и качество жизни пациенток [1,4,8,12]. Таким образом, вполне понятен возрастающий интерес врачей и пациентов к возможности сохранения менструальной и детородной функций у женщин с ЛХ.

Проведение химиотерапии у пациенток с ЛХ без защиты яичников может вызвать стойкое нарушение функции яичников, вплоть до аменореи, приводящей к обменно-эндокринным нарушениям, урогенитальным атрофическим процессам, увеличению числа сердечно-сосудистых заболеваний, раннему атеросклерозу и остеопорозу [3,4,5,7,10,14]. После целого ряда программ химиотерапии без защиты яичников, особенно содержащих высокие дозы алкилирующих препаратов, у 50%-70% пациенток репродуктивного возраста наступает преждевременная менопауза, и детородная функция не может быть реализована [5].

В последнее время обсуждаются различные лекарственные методы для защиты яичников во время проведения химиотерапии. Они включают в себя фармакологические методы такие, как снижение секреции гонадотропинов и подавление цикличности функции яичников при помощи агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона (а-ГнРГ) или комбинированных оральных контрацептивов (КОК), так и криоконсервацию ооцитов, эмбрионов или ткани яичника [2,3,4,5,6,14].

В данной работе были поставлены следующие задачи: 1. выявить основные факторы риска, приводящие к истощению фолликулярного резерва яичников до проведения противоопухолевой терапии. 2. определить схемы полихимиотерапии (ПХТ), при которых необходимо проводить защиту яичников. 3. оценить эффективность защиты яичников препаратами КОК и а-ГнРГ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Оценка характера менструальных циклов проведена у 236 женщин с лимфомой Ходжкина (средний возраст 25,2±5,5 лет), получавших различные схемы ПХТ, а также лучевую терапию (ЛТ) в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН с 1968 по 2009 годы. Из 236 женщин с ЛХ 76 получали малотоксичную для функции яичников полихимиотерапию (суммарная доза циклофосфана < 8гр). Остальные 160 женщин получали лечение по программам, в которых суммарная доза циклофосфана превышала 8гр. Сравнительный анализ методов защиты яичников (КОК или аГнРГ) после первой программы лечения проведен у 82 из 236 женщин, которые получали лечение по программе ВЕАСОРР-стандартный - от 4 до 8 циклов. В этой программе суммарная курсовая доза циклофосфана равна или превышает 8гр. Из 82 женщин 52 больных (1 группа) с целью защиты яичников получали комбинированные оральные контрацептивы (марвелон, регулон непрерывно на протяжении всего лечения), 24 пациентки (2 группа) – а-ГнРГ - золадекс (6-8 подкожных введений 1 раз в 28 дней) и 6 пациенток отказались от защиты яичников. Период наблюдения за женщинами 1 группы составил 9 лет (с 2000 по 2009 годы), а 2 гр. – 5 лет (с 2004 по 2009 годы). Более 50% (13 женщин) больным золадекс вводился в I фазу менструального цикла и до начала терапии проходило около 2 недель. У остальных женщин препарат вводился за несколько дней до менструации. Проведение гормонального скрининга через 4-6 месяцев после окончания терапии лимфомы Ходжкина и ультразвукового исследования матки и яичников проведено у 24 женщин 1 группы и у 20 женщин 2 группы. Контрольную группу составили 37 здоровых женщин репродуктивного возраста, без нарушений менструального цикла, обследованных в тот же период времени.

Для определения состояния функции яичников использовались: анамнестические данные, опрос больных, УЗИ органов малого таза, исследование гормонального статуса на основе имуноферментного анализа гормонов гипофиза (лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов), пролактина и половых стероидных гормонов (эстрадиола, прогестерона), тестостерона, половые стероиды связывающего глобулина (ПССГ) и ингибина В в сыворотке крови.

Определение половых стероидных и гипофизарных гормонов проводили стандартизованными методами прямого конкурентного иммунохемилюминесцентного анализа при использовании автоматического анализатора «ACS-180» («Bayer»). Концентрацию ПССГ определяли в образцах сыворотки крови методом типичного двухступенчатого иммуноферментного анализа при использовании стандартного набора «Sex hormone binding globulin (SHBG)» (Diagnostics Biochem Canada Inc., Канада). Определение концентрации ингибина В в сыворотке крови больных проводили методом двухступенчатого иммуноферментного анализа на основе стрептавидиновой технологии при использовании стандартного набора «Active Inhibin B ELISA» (DSL Inc., США).

Для дополнительной оценки стероидогенной функции яичников с учетом степени эстрогенизации и андрогенизации организма был выполнен расчет индекса свободных эстрогенов (ИСЭ) и индекса свободного тестостерона (ИСТ) по формуле, учитывающей концентрации гормонов и ПССГ: 

Статистическую обработку результатов проводили методом однофакторного дисперсионного анализа. В связи с отличным от нормального распределения Гаусса исследуемых биохимических показателей при статистической обработке использовали непараметрические тесты: тест Wilcoxon – для парных сравнений показателей; критерий c2 – для оценки различий частот; тест корреляции рангов Спирмена (rs). Обработка результатов проводилась на персональном компьютере с использованием пакета статистического анализа Analysis ToolPak – VBA и пакета программ Statistica for Windows, Release 4.3, STARSOFT Inc. Достоверность результатов подтверждалась непараметрическим методом Манн-Уитни; при множественных сравнениях рассчитывали точное значение уровня значимости р с помощью специальных тестов. Во всех случаях различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

При ретроспективном анализе, а также при проспективном исследовании удалось оценить характер менструальных циклов до начала лечения лимфомы Ходжкина у 146 больных. До начала лечения регулярность менструального цикла не была нарушена у 130 (89,0%, медиана возраста составила 24 года) больных, а у 16 женщин (11,0%, медиана возраста 23 года) выявлены нарушения функции яичников.

Нерегулярный менструальный цикл до начала терапии ЛХ статистически значимо чаще наблюдался у женщин с наличием симптомов интоксикации (р=0,004). При проведении корреляционного анализа выявлена четкая зависимость регулярности менструального цикла до начала лечения ЛХ от наличия В-симптомов (симптомов интоксикации) (р=0,0004), из них: от уменьшения веса более чем на 10% (р=0,04), от повышения t тела выше 380С (р=0,003) и от наличия профузных потов (р=0,002), а также от числа симптомов интоксикации (р=0,04). Нарушение менструальных циклов до начала лечения коррелировало с анемией (р=0,009) и большим объемом опухолевой массы (р=0,01). Регулярность менструального цикла до начала терапии ЛХ по данным корреляционного анализа, не зависела от возраста пациенток в дебюте заболевания.

В последние годы предпринимаются попытки выявить группу больных, для которых защита яичников наиболее актуальна. С этой целью проводилось исследование гормонального статуса женщин как до, так и после лечения у 79 пациенток с ЛХ. Нормальный гормональный статус был подтвержден у 13 из 20 (65%) пациенток с ЛХ, включенных в исследование в фолликулярной (I) фазе и 20 из 35 (57,1%) – в лютеиновой (II) фазе. У 22 пациенток определялись гормональные нарушения разной степени выраженности и направленности, из них у 8 женщин имелось исходное, до начала лечения, нарушение менструальной функции (у 6 – аменорея, у 2-х – олигоменорея) и наблюдались характерные изменения, выражающиеся в снижении до постменопаузальных уровней эстрадиола и прогестерона. Это позволяло думать о временной недостаточности функции яичников.

При оценке частоты нарушений гормонального статуса оказалось, что преобладающей особенностью явилось снижение секреции яичниковых гормонов. Это выражалось в развитии гипоэстрогении у 22,2% пациенток, уменьшении продукции прогестерона - у 28,6% и ингибина В - у 15,9% больных. Нарушение секреции гипофизарных гормонов отмечено у 20,7% пациенток и было разнонаправленным, при этом наблюдались случаи, как повышения, так и снижения уровней ФСГ и ЛГ по сравнению с соответствующими нормами. Гиперпролактинемия была обнаружена у 9,5% женщин, кроме того, были зарегистрированы 3 случая гипопролактинемии, сопутствующие нарушению менструального цикла. В целом по группе нарушения гормонального баланса были обнаружены у 47,6% включенных в исследование пациенток, который проявлялся изменением, как отдельных гормонов, так и их различных сочетаний.

Таким образом, результаты комплексного клинико-лабораторного исследования свидетельствуют о том, что в отличие от здоровых женщин аналогичного возраста при ЛХ выявляются нарушения гормонального статуса, характеризующиеся снижением уровней яичниковых гормонов и, прежде всего, эстрадиола и ингибина В. Выявленное снижение уровней гонадотропных гормонов позволяло думать о гипогонадотропном гипогонадизме, а повышение гонадотропинов указывало на преждевременную недостаточность яичников.

После проведения химиотерапии группа с нарушением функции яичников увеличилась и составила 41,5% (98 больных). Прежде всего, это зависело от схемы проводимой ПХТ, от возраста больной, в котором проводилось лечение, а также от проведения терапии, направленной на защиту яичников (таблица 1).

У пациенток с исходно измененными по отношению к соответствующим нормам уровнями гормонов характер менструальных циклов после лечения нарушился в 50% случаев и почти в 2,5 раза реже (21,8%) – при исходно нормальном гормональном статусе (р=0,007). В целом по группе после химиотерапии обнаруживались: гипоэстрогения у 36,1% пациенток, снижение уровней прогестерона – у 63,9% и ингибина В – у 52,8% больных. Гиперсекреция ФСГ и ЛГ выявленная соответственно в 47,2% наблюдений указывает на развившуюся преждевременную недостаточность или временное выключение функции яичников. В 8,3% случаев определялась гиперпролактинемия, которая как правило, сопровождалась гипогонадотропным гипогонадизмом. Вполне возможно, что это закономерная реакция на стресс.

При проведении корреляционного анализа в группе в целом выявлено, что сохранность менструального цикла после лечения ЛХ зависит от: возраста женщин (р=0,000001), от наличия В-симптомов – за счет больных с уменьшением веса более чем на 10% (р=0,04), от стадии заболевания (р=0,00004), от общего состояния больных (статус по ЕСОG-ВОЗ 3-4), (р=0,002), от наличия анемии (р=0,04), от альбуминемии (р=0,008) и от проведения облучения пахово-подвздошных лимфатических узлов (р=0,003).

Для вычисления свободных биологически активных фракций эстрадиола и тестостерона определяли глобулин, связывающий половые стероиды (ПССГ), который синтезируется в печени (табл. 2). Следовательно, после химиотерапии было получено закономерное снижение ПССГ, что, по-видимому, связано с токсическим влиянием химиотерапии на функцию печени. Поэтому при вычислении по формуле свободных фракций эстрадиола и тестостерона могло быть ложно завышенным из-за низкого уровня ПССГ, и истинные уровни свободных половых стероидов были ниже вычисленных. Несмотря на выраженную вариабельность, снижение ПССГ, ИСЭ и ИСТ после химиотерапии по сравнению с исходными значениями было статистически значимым (р<0,01-0,05).

Для оценки клинической значимости исследования гормонального статуса у пациенток с ЛХ результаты, полученные при определении яичниковых и гипофизарных гормонов были подвергнуты дополнительному статистическому анализу для расчета количественных критериев с целью использования их в качестве факторов риска нарушения функции яичников. С помощью метода ROC был выполнен сравнительный анализ распределений исходных уровней гормонов в сыворотке крови пациенток с ЛХ с учетом состояния и фазы менструального цикла после химиотерапии. В результате проведенного анализа были получены пороговые значения для эстрадиола и ингибина В. При гипоэстрогении частота развития дисфункции яичников у пациенток с исходно сохранным циклом составила 62,5%, тогда как при значениях эстрадиола > 200 пмоль/л – 26,7%, р=0,045. Частотный анализ показал статистически значимое увеличение относительного риска нарушения функции яичников у таких пациенток - в 2,6 раза. Аналогичный анализ с учетом порогового уровня ингибина В при исследовании в фолликулярной фазе цикла доказал возможность его использования для оценки относительного риска развития аменореи. Этот риск оказался в 10 раз выше при значениях гормона <40 пг/мл, чем при более высоких показателях и эти различия были статистически значимы (р=0,003). У пациенток с низкими уровнями ингибина В в I фазе менструального цикла вероятность его нарушения достигала 75% , тогда как при уровнях > 40 пг/мл – лишь 6,7%. 

Для повышения точности прогноза нарушения функции яичников после лечения ЛХ на основе рассчитанных пороговых уровней эстрадиола и ингибина В была проведена оценка использования их сочетания в общей группе пациенток, которая показала, что независимо от фазы цикла при значениях гормонов ниже пороговых вероятность развития недостаточности яичников достигала 67%, тогда как при превышающих пороговые уровни показателях эстрадиола и ингибина В вероятность развития дисфункции составляла лишь 16,7%.

Следующим этапом работы было сравнение эффективности двух методов защиты яичников (КОК и а-ГнРГ). Средний возраст женщин (n=76), получавших КОК и а-ГнРГ составил 24,4±5,6 и 24,7±5,7 лет соответственно. Распределение женщин по возрасту, особенностям менструальной и репродуктивной функций, а также онкологическому статусу (гистологический вариант, стадия и другие неблагоприятные прогностические признаки) не отличались в этих группах.

После проведения противоопухолевого лечения, клинически нарушение менструального цикла после химиотерапии по типу олигоменореи констатировано у 23 (30,3%) женщин, из них 19 пациенток получали КОК и 4 – золадекс. У 10 (19,2%) пациенток, получавших КОК, наступила аменорея. В группе женщин, получавших золадекс, через 6 месяцев после противоопухолевого лечения аменореи не было отмечено ни у одной больной. При корреляционном анализе в группе женщин до 25 лет риск наступления аменореи зависел только от числа циклов ВЕАСОРР (р=0,038). Выявлена высокая степень корреляции частоты возникновения аменореи в группе больных старше 25 лет в зависимости от наличия симптомов интоксикации (р=0,04).

При назначении а-ГнРГ у 62,5% женщин отмечались вегето-сосудистые явления – приливы, потливость, слабость, головные боли, проходящие сразу после отмены препарата. После окончания полихимиотерапии у женщин, получавших а-ГнРГ, наблюдалась транзиторная аменорея, менструальный цикл восстанавливался в среднем через 3-4 месяца. В группе женщин, получавших КОК, в большинстве случаев в первые 2 месяца отмечалась менструация или менструальноподобная реакция. Характер менструального цикла клинически оценивался в группах через 6 месяцев и не был нарушен у 43 из 76 (56,6%) женщин. Среди 52 женщин, получавших КОК менструальный цикл не был нарушен у 23 (44,2%) и у 20 (83,3%) из 24 женщин, получавших золадекс. Частота сохранения нормальной менструальной функции была статистически значимо выше в группе женщин, получавших а-ГнРГ (р<0,001). Следует подчеркнуть, что у всех 6 женщин, отказавшихся от защиты яичников при проведении лечения по программе ВЕАСОРР, диагностировалось преждевременное истощение яичников.

Данные гормонального скрининга (24 женщины, получавших КОК и 20 женщин, получавших а-ГнРГ в сравнение с контрольной группой - 37 женщин репродуктивного возраста без ЛХ и регулярным менструальным циклом) представлены в таблице 3. В группе пациенток, получавших в качестве защиты яичников КОК выявлено достоверное повышение уровня ФСГ и ЛГ по сравнению с женщинами, получавшими а-ГнРГ: 39,2±26,1МЕ/л против 11,2±9,5МЕ/л, р<0,01 и 26,5±17,9МЕ/л против 13,6±9,9МЕ/л, р<0,05 соответственно, а также снижение уровня прогестерона через 6 месяцев после проведения ПХТ.

Ультразвуковое исследование яичников проводилось до проведения противоопухолевого лечения, а после противоопухолевого лечения в среднем через 2,1 и 1,9 лет в 1 и 2 группах. Особенности объема яичников, а также фолликулярного аппарата зависели от метода защиты яичников (табл. 4). Снижение объема яичников и истощение фолликулярного аппарата наблюдались чаще у женщин, которым проводилась защита яичников комбинированными оральными контрацептивами. У 6 из 24 женщин, получавших КОК после проведенного лечения, яичники не визуализировались либо с одной стороны, либо с обеих, а у 5 женщин количество антральных фолликулов, определявшихся в яичниках, было менее 5.

Обсуждение полученных результатов.

Больные, излеченные от лимфомы Ходжкина молоды, они ведут активный образ жизни: они работают, учатся, вступают в брак и, конечно же, как и все люди хотят иметь детей, что, к сожалению, не всегда оказывается возможным. Поэтому, повышение качества жизни этих больных является столь же важной задачей, как и излечение от самого онкологического заболевания.

Хорошо известно, что полихимиотерапия и лучевая терапия могут привести к повреждению гонад и замещению их соединительной тканью, усилению апоптоза гормонально-активных клеток, а также индуцировать овариальную атрофию и аменорею [6,7,13]. В большинстве работ зарубежных и отечественных авторов основное внимание уделяется влиянию противоопухолевой терапии на функцию яичников, однако не было попыток провести анализ ее нарушения в зависимости от состояния яичников до проведения этой терапии. В данной работе впервые получены новые данные о том, что у части женщин с ЛХ выявляются нарушения гормонального статуса уже до проведения противоопухолевого лечения, характеризующиеся снижением уровней яичниковых гормонов и, прежде всего, эстрадиола и ингибина В и что эти нарушения влияют на возможность восстановления функции яичников после лечения.

Патогенез повреждающего воздействия химиотерапии состоит в следующем (рис. 1). Под воздействие гонадотоксической терапии фолликулы, вступившие в фазу роста или находящиеся в ранней фазе стимуляции гипофизом, подвергаются атрезии [6]. Цитотоксичность алкилирующих агентов связана с образованием внутри- и межмолекулярных поперечных сшивок ДНК-ДНК, которые изменяют матричные свойства ДНК в процессах репликации и транскрипции с последующим блоком митозов, несбалансированным ростом и гибелью клеток. Таким образом, алкилирующие химиопрепараты повреждают в первую очередь клетки с активной репликацией ДНК, но не действуют на клетки, находящиеся в G0-фазе – фазе покоя. В результате атрезии фолликулов снижается секреция эстрадиола и ингибина В, что в свою очередь ведет к повышению концентрацию ФСГ в следствие отрицательной обратной связи. Повышенный уровень ФСГ вызывает повышенное образование фолликулов и дальнейшую их гибель под воздействием химиопрепаратов [6,13].

В соответствии с этим очевидно, что коррекцию гормональных нарушений у пациенток с ЛХ необходимо начинать в наиболее ранние сроки – до начала химиотерапии. Было выявлено, что у пациенток с измененными по отношению к соответствующим нормам уровнями гормонов менструальная функция после лечения нарушилась в 50% случаев и почти в 2,5 раза реже (21,8%) – при исходно нормальном гормональном статусе (р=0,007). При исходной гипоэстрогении у пациенток с сохраненным менструальным циклом частота развития более выраженных нарушений функции яичников составила 62,5%, тогда как при значениях эстрадиола >200 пмоль/л статистически значимо реже - у 26,7% женщин, р=0,045. Частотный анализ показал статистически значимое увеличение относительного риска нарушения функции яичников у таких пациенток в 2,6 раза. Аналогичный анализ с учетом порогового уровня ингибина В при исследовании в фолликулярной фазе цикла доказал возможность использования этого показателя для оценки относительного риска развития аменореи, который в 10 раз выше при значениях гормона менее 40 пг/мл, чем при более высоких показателях и эти различия были статистически значимы (р=0,003).

Представленные наблюдения подтверждают клиническую значимость исследования гормонов при первичном обследовании пациенток с ЛХ, а также после лечения для оценки прогноза нарушения функции яичников и обоснования последующего назначения гормональных препаратов с целью профилактики наступления преждевременной менопаузы. Рассчитанные пороговые уровни эстрадиола и ингибина В позволили оценить с высокой вероятностью риск нарушения функции яичников после химиотерапии и у пациенток с первоначально сохранным менструальным циклом.

Учитывая тот факт, что наиболее выраженные нарушения гормонального статуса (высокая частота гипоэстрогении, снижение ингибина В) наблюдались у женщин с неблагоприятными прогностическими признаками ЛХ (потеря веса и другие симптомы интоксикации, а также генерализованные стадии), можно предположить, что лимфома Ходжкина и последующая химиотерапия приводят к истощению компенсаторных резервов яичников с возможным сдвигом гормональных соотношений в системе гипоталамус-гипофиз-яичники. У большинства женщин, у которых симптомы интоксикации выражаются в большой потере веса, отмечается аменорея. Патогенетические механизмы развития аменореи на фоне потери массы тела связаны с нарушением нейромедиаторного обмена центральной нервной системы - с уменьшением продукции гонадотропного релизинг-гормона.

Тот факт, что химиопрепараты не действуют на клетки, находящиеся в G0-фазе – фазе покоя и в связи с этим отсутствие повреждающего действия алкилирующих агентов на яичники девочек в препубертатном возрасте, обосновало использование КОК и а-ГнРГ для предотвращения рекрутирования примордиальных фолликулов [6,13]. При назначении а-ГнРГ и КОК снижается уровень ФСГ (см. рис. 1), что ведет к снижению восполнения и соответственно последующей атрезии новых фолликулов. При назначении а-ГнРГ, вследствие первоначального связывания с рецепторами ГнРГ, сначала происходит повышение уровня гонадотропинов, что приводит к стимуляции яичников. Для того чтобы этого избежать обычно а-ГнРГ назначают за несколько дней до менструации. После первоначального стимулирующего эффекта, а-ГнРГ вызывают гипогонадотропное состояние через 1-3 недели после назначения.

В данном исследовании использование гормональных препаратов (КОК и а-ГнРГ) с целью защиты яичников при проведении химиотерапии, включающей высокие дозы алкилирующих препаратов, позволило сохранить менструальную функцию у большего числа женщин, больных ЛХ. Программа лечения по схеме ВЕАСОРР, включающая суммарные курсовые дозы циклофосфана в 8 и более грамм, высокотоксична для ткани яичников, причем, чем старше пациентка, тем меньше фолликулярный резерв фолликулов и тем более выражен цитотоксический эффект. Данные нашего исследования (оценка менструальных циклов, гормонального статуса, ультразвуковые данные) подтверждают более выраженный эффект при применении для защиты яичников а-ГнРГ по сравнению с КОК.

Несмотря на защиту яичников во время противоопухолевого лечения, у 11 женщин (10 женщин, получавших КОК, и одной, получавшей а-ГнРГ) диагностирован синдром преждевременного истощения яичников – вторичная олигоменорея или аменорея, вегетососудистые нарушения, повышение уровня ФСГ и ЛГ более 40 МЕ/л, истощение фолликулярного аппарата по данным УЗИ. Основной жалобой у данных пациенток было бесплодие, у некоторых – симптомы эстроген-дефицита. В данном исследовании у 2 женщин с преждевременным истощением яичников при заместительной гормонотерапии фемостоном 2/10 наступила беременность, которая закончилась своевременными родами. Однако единственным надежным методом наступления беременности у подавляющего большинства женщин с синдром ПИЯ является донация яйцеклетки в рамках программы ЭКО, что и было произведено с положительным результатом у одной пациентки с ЛХ из этой группы.

Таким образом, учитывая высокую курабельность ЛХ, предполагающую выздоровление большинства больных, в настоящее время при выборе программы лечения необходимо отдавать предпочтение программам, обладающим высокой эффективностью и низкой токсичностью и шире использовать различные протекторы для защиты яичников, такие как КОК и а-ГнРГ. Для женщин до 25 лет с регулярным менструальным циклом и уровнем эстрадиола выше 200 пмоль/л и ингибина В выше 40 пг/мл при лечении по программам с высокими дозами алкилирующих препаратов, защита яичников комбинированными оральными контрацептивами может оказаться достаточной. Однако у женщин более старшего возраста и у молодых женщин с исходно нарушенным менструальным циклом и/или нарушенными уровнями эстрадиола и ингибина В предпочтительнее использование агонистов гонадотропин-рилизинг гормона, а также дополнительные методы репродуктивной технологии (криоконсервация ткани яичника, эмбриона и др).